تقنية PCR و تطبيقاتها في الأغذية

**مهندس عصام** الأربعاء مايو 12, 2010 2:34 am

تقنية PCR و تطبيقاتها في الأغذية

نظرا للتقدم السريع و الملحوظ في مجال البيولوجيا الجزيئية Molecular Biology في السنوات الأخيرة ، كان لابد من الإستفادة به في مجال الرقابة الصحية على الأغذية و منتجاتها و خاصة في حالات الكشف السريع عن الميكروبات المرضية الملوثة للأغذية و المسببة لبعض أمراض التسمم الغذائي و التأكد من سلامة الغذاء و خلوه من هذه الميكروبات ، و نتيجة لذلك تم إستخدام طريقة التضخيم المتسلسل للصفات الوراثية للميكروبات
(Polymerase Chain Reaction (PCR ، حيث تعتبر من التقنيات الحديثة و السريعة في كثير من المجالات المختلفة الطبية و الزراعية ز الوراثية و في مجال مراقبة الجودة على الأغذية للكشف السريع عن الميكروبات المرضية و الملوثة للأغذية .

تفاعل البوليمراز السلسليPolymerase Chain Reaction (PCR):

تهدف تقنية PCR إلى تضخيم جزيئات قليلة من الحمض النووي DNA، بعد استخلاصه من خلايا أو سوائل الجسم وبالتالي الحصول على كميات كبيرة منه بحيث يمكن إجراء التحليل عليها.
إخترعت هذه التقنية من قبل Kary Mullis التي منحت جائزة نوبل في الكيمياء لهذا الإنجاز .

يمكن اعتبار تقنية PCR ترجمة مبسطة لعملية انتساخ الحمض النووي DNA أثناء الانقسام الخلوي( لكن هذا الإنتساخ يتم خارج الجسم ؛ حيث يتم السيطرة على البيئة خارج الكائن الحي ) .ولكي يتم هذا الانتساخ، لا بد من توفر مواد معينة تساعد على ذلك:
1. المبادئات Primers وهي عبارة عن نيوكلوتيدات قليلة Oligonucleotides (18 – 20 أساس آزوتي) قادرة على الارتباط مع الأسس الآزوتية للحمض النووي المراد تضخيمه، وذلك في منطقة ذات ترتيب مميز ونوعي غير متبدل للأسس الازوتية في الحمض النووي أو ما يعرف بمنطقة عالية الحفظ Highly Conserved Region .
.2 كميات وافرة من النيوكليوزيدات ثلاثية الفوسفات منقوصة الأوكسجين
(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)Deoxynuleoside triphosphates(dNTPs)
.3 أنزيمات البوليميراز Polymerase مقاوم للحرارة المرتفعة، وأهمها Taq Polymerase المستخلص من بكتيريا تعيش في الينابيع الحارةThermus aquaticus.
.4 محاليل واقيه Buffers
.5 شوا رد مناسبة، أهمها شاردة المغنيزيوم Mg+2 التي تعتبر عامل متمم Cofactor لأنظيم البوليمراز.
يعتمد PCRعلى التبديل المتناوب لطبيعة جزيئات DNA الثنائية ( إذابة ) و إعادة طبيعة ( تلدن ) السواحل الوحيدة المكملة في الطراز المنتظم .

إن المتطلب الثاني للـ PCR هو القدرة على تركيب Oligonucleotides محددة و تشفعها لمدة طويلة مع سلسلة محددة من ال DNA.
حيث تعمل هذه النيوكلوتيدات كمبادئ قراءة لتأليف سلسلة DNA بوجود(dNTPs) و أنزيم Taq Polymerase هذا الأنزيم يمكن أن يبقى نشيط حتى بعد أن يسخن إلى 95ْ م و يمكنه أن يضخم مبادئ القراءة في درجات تصل إلى 72 ْ م .

تصميم مبادئ القراءة Primer
مبادئ القراءة عبارة عن جزيئاتDNA قصيرة طولها عادة من 18 – 35 نيوكلوتيد تضخم لترتبط بشكل إنتقائي بالسلاسل المكملة من قطعة ال DNA.
أثناء تلدين مبادئ القراءة ، مبادئ قراءة واحد يجب أن ترتبط في المقدمة و المبادئ الآخر يجب أن يرتبط في مسافة محددة في الإتجاه العكسي إلى سواحل DNA المنفصلة( شكل 1) ، لذا فأن تصميم مبادئ القراءة يعتبر خطوة حرجة في تقنية PCR ، لأن مبادئ القراءة يجب أن يملك التحديد المطلوب و بعبارة أخرى فإنه يجب توافر السلاسل DNA المميزة للكائن الحي لتكون هذه التقنية فعالة في الكشف و التحليل . لأجل ذلك قام العديد من الباحثين بإجراء بعض الأبحاث و وضعوا قائمة تتضمن 10 شروط لتصميم مبادئ قراءة يستخدم في هذه التقنية :
1- يجب أن يكون طول المبادئ بين 18 –30 نيوكلوتيد . و كلما كان طول المبادئ أكبر فإن ذلك يعطي مساحة أكبر لمواضع الأنزيم على المبادئ و بالتالي نوعية أفضل .
2- يجب أن لايكون الفرق في درجة حرارة الإنصهار في المبادئات المستخدمة أكثر من 5 درجات مئوية و يمكن حساب درجة حرارة الإنصهار حسب المعادلة التالية :

Tm = 4(G+C) +2(A +T) cْ
3- جعل درجة حرارة الإنصهار بين 65 و 70 ْ م لكل بادئ فوق منطقة التلدين .
4- إستعمال درجة حرارة تلدين ( ta ) أقل ب (10- 15 ْ م ) من tm .
5- محتوى G و C من كل مبادئ ينبغي أن يكون في المجال ( 40- 60 % ) من أجل الفعالية القصوى لل PCR .
6- الحصول على توزيع موحد من نيوكلوتيدات G و C ، حيث غياب هذا التوزيع يؤدي إلى تلدين غير إنتقائي ( غير نوعي ) .
7- تفادي تعاقبات طويلة من نفس النيوكلوتيد .
8- يجب أن لا يكون مبادئ القراءة مكمل ذاتيا ، أو مكمل إلى مبادئ قراءة آخر في خليط التفاعلات ، حيث هذا يشجع على تكوين مبادئ قراءة من نوع dimmers (ثنائي الجزيئات ) حيث هذا النوع من المبادئات سينافس نسخة DNA على إستعمال مبادئ القراءة و الكاشف .
9- إذا كان بالإمكان جعل النهاية 3 َ تنتهي ب C أو A فإن ذلك سيزيد فعالية الكشف .
10- يمكن تفادي أخطاء التلدين بجعل النهاية 3 َ صافية إلى حد ما .

دورة PCR :

تتم تفاعلات PCR في جهاز يسمى Temperature controller ، تكرر هذه التفاعلات عدة مرات تسمى كل مجموعة من هذه التفاعلات ( بدورة التفاعلات ) قد يصل عدد هذه الدورات إلى 25-40 دورة تفاعل .
في كل دورة يجري ثلاث أنواع من التفاعلات :

1- التفاعل الأول(الإذابة ) : التمسخ الحراري Thermal denaturation لجزيءDNA الهدف، أي فصل الجزيء المزدوج ds-DNA إلى جزيئين منفصلين ss-DNA، حيث يتم دنترة ال DNA على درجة حرارة 94 م لمدة دقيقة .
2- التفاعل الثاني( التلدين ) : تشفع( إلتحام ) المبادئات Primers annealing، أي ارتباط كلا البادئتين مع الجزيئين المنفصلين عند درجة حرارة 55م و يراعى في هذا التفاعل أنه إذا إنخفضت درجة الحرارة بدرجة ملحوظة فإن بعض البادئات سوف ترتبط في مناطق قد لا تحتوي على ترتيب متجانس من القواعد و بالتالي تتكون مخاليط قصيرة و غير مماثلة لجزيء DNA المراد تكبيره
.
التفاعل الثالث( الإستطالة ) :تطاول البادئات المتشفعة Annealed primers extension بمساعدة أنزيم البوليمراز وذلك بإضافة dNTPs ابتداء من البادئة وفي الاتجاه 3← 5، وتتم هذا التفاعل عند درجة حرارة 72 م.بحيث يوفر البادئ الطرف end-3 بينما يوفر شريط DNA المدنتر الجزيء المكمل .
و بتكرار هذه العملية يعاد رفع درجة الحرارة لإعادة دنترة جزيء ال DNA المتكون من التفاعل الأول ، حيث ينفرد الشريطين و بخفض درجة الحرارة يبدأ تفاعل annealing ثم تفاعل extension للبادئ كما في السابق.

الدرجات المتكررة للذوبان ( التسخين ) و التأليف ( تبريد ) تضخم السلسلة بسرعة . في كل دورة عدد نسخ السلسلة بين مواقع مبادئ القراءة مضاعفة لذا تزداد السلسلة المطلوبة تصاعديا حوالي مليون ضعف بعد 20 دورة بينما كل السلاسل الأخرى في عينة DNA الأصلية تبقى غير مضخمة ، و هكذا في كل مرة يتم مضاعفة كمية من DNA التي بدأ بها التفاعل كمتوالية هندسية .

عامل التضخيم :

و يعطى معامل التضخيم بالمعادلة التالية

A = n(1+E)X
A =.عامل التضخيم
n :.الكمية المبدئية من الحمض النووي المستهدف (
E: (Efficiency) فعالية التضخيم .
x: PCR عدد دورات
الكشف عن منتجات التضخيم :
يمكن الكشف عن منتجات التضخيم بعدة طرق أهمها :

1 الرحلان الكهربائي على هلام الآغاروز Agarose Gel Electrophorsis .

.2 التهجين Hybridizationباستعمال مسابر موسومة بأنظيم Enzyme Labeled Probes
.3 استخدام بادئات موسومة بأنظيم أو مادة تألقية Enzyme Fluoresent Labeled Primers
.4 تقنية تعدد اشكال اطوال الشدف الحصريه

(RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism

.5 التنسيل Cloning

إستخدام PCR في مجال الأغذية
الأحماض النووية الموجودة في الغذاء ليس لها قيمة تغذوية كبيرة ، لكنها مميزة للمكونات الحيوية المختلفة .
تحليل الأحماض النووية في الأغذية يسمح بتحديد الخصائص المميزة لمكونات الغذاء ، و في الكشف عن بعض المحسسات و بعض الملوثات في المنتجات الغذائية النهائية ، بالإضافة لذلك فإن تحليل الأحماض النووية يسمح بالكشف عن الأنواع النباتية و الحيوانية . و بسبب سرعته و حساسيته العالية فإن تفاعل PCR يكون الطريقة المثلى للتحليل.

إن تحليل الأغذية بإستخدام تقنية PCR يتضمن الخطوات التالية :
1- عزل ال DNA من الغذاء
2- تضخيم السلاسل المستهدفة بواسطة PCR
3- حقن منتجات التضخيم بهلام Agarose
4- فصل منتجات التضخيم بإستخدام الرحلان الكهربائي Electrophorsis
5- تقدير حجم الجزيئات و ذلك بعد الصبغ ببروميد Ethidium بوجود
6- أخيرا التحقق من نواتج PCR بواسطة أنزيم restriction endonuclease ( أنريم أندو نيوكلييز ) ثم الفحص مصدر للأشعة البنفسجية عند طول موجة 312 نانومتر و تصور بإستخدام آلة تصوير .

هذا و عند عزل DNA الكائن الحي تتم عملية الإغناء الإنتقائي ( التحضين في بيئة مناسبة على درجة حرارة معينة و لمدة محددة ) و ذلك للحصول على كمية من DNA يمكن كشفها . و بإعتبار أن هذه الطريقة تحتاج إلى وقت طويل يمكن الإستعاضة عن ذلك بإستخدام تقنية PCR المباشر ( الفوري ).

تطبيقات PCR في الأغذية :
توجد لتقنية الـ PCR العديد من التطبيقات في مجال صحة و سلامة الأغذية عن طريق الكشف السريع على الميكروبات المرضية في اللحوم و الدواجن و منتجاتها و ففي الأغذية المصدرة و المستوردة للتأكد من خلو هذه الأغذية منها .

(Ghazi and Hatano , 1998 ; Miyamoto et al , 1997 and Zhu et al , 1996) إستخدموا PCR كطريقة سريعة للكشف عن الـ Salonella
المسببة لبعض أمراض التسمم الغذائي في بعض منتجات اللحوم اليابانية و المصرية ( شرائح اللحم المنضج Ham ، السجق ، اللانشون ، البسطرمة ) .

(Soumet et al , 1994) درسوا تأثير إستخدام 6 طرق مختلفة لإستخلاص الـ DNA على كفاءة إستخدام الـ PCR كطريقة سريعة و حساسة للكشف عن بكتريا السالمونيلا في الدواجن .

(Niederhauser et al , 1992 ) إستخدموا طريقة PCR للكشف السريع عن Listeria monocytogens في الجبن الطري كطريقة سريعة و فعالة لمراقبة منتجات الألبان